Asignaciones de medios de cultivo

F. Tema: Cultivo de Microorganismos. Objetivos: Definir medio de cultivo. e Conocer las necesidades nutricionales y ambientales necesarias para el desarrollo microbiano. e Conocer a promover o discriminar el crecimiento bacteriano en un medio de cultivo. e Diferenciar las diferentes hemolisis que causan las bacterias en el agar de sangre. Diferenciar entre cultivo puro y axénico. El aislamiento de bacterias se logra cultivandolas ("haciéndolas crecer") en la superficie de medios nutritivos solidos. Dicho medio normalmente consiste en una mezcla de digeridos de proteinas (peptona, triptona, etc.) y sales inorganicas, endurecido mediante la adicion de 1.5% de agar. Los ejemplos de medios estandar de uso general que respaldaran el crecimiento de una amplia variedad de bacterias incluyen agar nutritivo, agar de soja triptico y agar de infusion de cerebro y corazon. Un medio puede estar enriquecido, es decir, mediante la adicidon de sangre o suero. Los ejemplos incluyen agar de sangre de oveja y agar de chocolate (sangre calentada). Los medios selectivos contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de algunos organismos, pero permiten que otros crezcan. Por ejemplo, el agar de manitol y sal contiene una alta concentracion de cloruro de sodio que inhibe el crecimiento de la mayoria de los organismos, pero permite que crezcan los estafilococos. Los medios diferenciales contienen compuestos que permiten que los grupos de microorganismos se distingan visualmente por la apariencia de la colonia o los medios circundantes, generalmente sobre la base de alguna diferencia bioquimica entre los dos grupos. El agar sangre es un tipo de medio diferencial, que permite distinguir las bacterias por el tipo de hemolisis producida (ver a continuacion). Algunos medios diferenciales tambi€n son selectivos, es decir, la mayoria de los agaricos entéricos estandar tales como los agares MacConkey y EMB, que son selectivos para coliformes Gram negativos y que diferencian a las bacterias fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. Hemodlisis: La observacion de las reacciones hemoliticas en agar sangre es una herramienta muy util en la identificacion de bacterias, particularmente estreptococos. Los tipos de hemolisis se definen de la siguiente manera: 77

Hemolisis alfa (a): Aparece una zona indistinta de destruccion parcial de globulos rojos (RBC) alrededor de la colonia, a menudo acompaifiada de una decoloracion verdosa del medio. Streptococcus pneumoniae y muchos estreptococos orales son a hemoliticos. Beta () hemolisis: Aparece una zona clara e incolora alrededor de las colonias, en la que los globulos rojos se han sometido a una lisis completa. S. pyogenes, S. agalactiae y varias otras especies de estreptococos son B hemoliticas. Muchas otras bacterias ademas de los estreptococos pueden ser B hemoliticas, incluyendo Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa 'y Listeria monocytogenes, y las reacciones hemoliticas también pueden ser una herramienta de diagnostico util para estos organismos. Hemolisis no (y): la colonia no produce aparente actividad hemolitica o decoloracion (también llamada hemolisis gamma). Medio de Cultivo para bacterias A continuacion, se muestran varios ejemplos de medios bacteriologicos cominmente utilizados, asi como ejemplos con uno o mas tipos de bacterias cultivadas en ellos. Examine cuidadosamente las placas y observe la morfologia, los colores y los patrones de crecimiento (o ningln crecimiento) de la colonia que ocurren. Esta informacion puede ser valiosa en la identificacion preliminar de patégenos en estudios de casos. A. Medios Comunes Bacteriologicos Tryptic Soy Agar (TSA) Tipo: General Proposito: Cultivo de bacterias no fastidiosas Interpretacion: el crecimiento indica bacterias no fastidiosas presentes Ejemplos S. aureus E. coli P. aeruginosa g ) \‘ N \ 3 : \\“ | / / ./ .-",l/. 5z ‘ — ) 78

MacConkey (lactose) Agar Tipo: Selectivo y Diferencial Proposito: Contiene sales biliares y cristal violeta que selecciona entéricos Gram negativos, diferencia los fermentadores de lactosa de los no fermentadores. Puede incluir aziicares que no sean lactosa para una mayor diferenciacion (por ejemplo, para diferenciar E. coli enterohemorragica (EHEC), que no fermenta el sorbitol, de otros tipos de E. coli que si lo hacen). Interpretacion: Selecciona para Gram negativos no fastidiosos; colonias rojas indican fermentacion de lactosa, el blanco indica que no hay fermentacion de lactosa. Ejemplos E. coli N. gonorrhoeae S. enteritidis S. aureus > Eosin-methylene Blue Agar (EMB) \___/' Tipo: Diferencial (lactosa) y Selectivo (inhibicion del tinte y precipitacion a pH acido). Proposito: Diferencia los fermentadores de lactosa (E. coli) de los no fermentadores (Salmonella, Shigella) Interpretacion: fermentadores de lactosa azul / negro; no fermentadores incoloros o de color violeta claro. Ejemplos S. enteritidis E. coli K. pneumoniae 80

Hektoen Agar Tipo: Selectivo y Diferencial Proposito: Detecta la fermentacion de la lactosa, produccion de H»S, inhibe los no entéricos Interpretacion: fermentadores de lactosa de color amarillo o salmén, no fermentadores incoloros; La produccion de H2S produce precipitado negro. Ejemplos E. coli S. enteritidis Mannitol Salt Agar | Tipo: Selectivo y Diferencial Propaosito: Seleccionado para Staphylococos, que crecen a altas concentraciones de sal; diferencia Staphylococcus aureus de otros estafilococos Interpretacion: Staphylococcus aureus es amarillo (fermenta manitol), otros estafilococos son blancos. Ejemplos S. epidermidis S. aureus E coli wws 81

Materiales: Utilizamos el m6dulo de Michigan State University, Virtual Interactive Bacteriology Laboratory. Material de la clase. Definicion: Medio general: es aquel que respaldaran el crecimiento de una amplia variedad de bacterias. Medio enriquecido: es aquel que puede tener adicional al medio general: sangre o suero. Medios selectivos: contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de algunos organismos, pero permiten que otros crezcan. Medios diferenciales: contienen compuestos que permiten que los grupos de microorganismos se distingan visualmente por la apariencia de la colonia o los medios circundantes, generalmente sobre la base de alguna diferencia bioquimica entre los dos grupos. Hemolisis: La observacion de las reacciones hemoliticas en agar sangre es una herramienta muy util en la identificacion de bacterias, particularmente estreptococos. Los tipos de hemolisis se definen como: alfa, beta y gamma. H2S (Sulfito de Hidrogeno): Compuesto quimico con caracteristicas de olor a huevo podrido. Es muy peligroso, corrosivo y flamable. Cultivos Puros: es aquel medio artificial donde todas las células bacterianas son semejantes y se originan de una sola c€lula, para conservar las caracteristicas genéticas puras. Cultivos Axénico: es aquel donde se cultiva en un medio libre, sin control alguno. Desarrollo: Luego de haber observado y analizado los varios ejemplos de medios bacteriologicos o placas y observe la morfologia, los colores y los patrones de crecimiento (o ningliin crecimiento) de la colonia. En grupo de tres o cuatro participantes desarrolle las siguientes preguntas para ser discutidas en clase, con lo observado en este modulo y los conocimientos adquiridos en clase: 1. 2. ,Qué es un medio de cultivo? Defina medio selectivo y medio diferencial. JPor qué utilizamos medios selectivos y diferenciales en la identificacion de los microorganismos? . Qué diferencias hay entre los medios? . Qué ingredientes se utilizan para promover o discriminar el crecimiento de los microorganismos? . Cudl es la diferencia entre un medio puro y uno axénico? 83

G. Tema: Susceptibilidad de bacterias. Objetivos: e Conocer ¢l proposito, mecanismo, componentes y método e interpretacion de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana. e Interpretar resultados de laboratorio. Hay varios factores a considerar al elegir un antibidtico apropiado para el tratamiento de una infeccion bacteriana. E1 mas basico de estos es si el organismo causal es susceptible a un antibiodtico en particular, y cuanto de ese antibiotico sera necesario para inhibir o matar al organismo. Si bien sabemos mucho sobre qué antibioticos son eficaces contra qué microbios en general, el problema generalizado de la resistencia a los antibidticos hace que sea esencial determinar la susceptibilidad de un aislado bacteriano determinado a multiples antibioticos en un corto tiempo para determinar el tratamiento mas efectivo. Se han desarrollado varios métodos estandar para medir la susceptibilidad de cepas bacterianas a antibioticos, y el método de difusion de disco de Kirby-Bauer es cominmente utilizado en laboratorios de microbiologia clinica y ha sido estandarizado en los EE. UU. Por el Comité Nacional de Estandares de Laboratorio Clinico. El método de Kirby-Bauer es conveniente ya que la susceptibilidad de los patégenos bacterianos a multiples agentes antimicrobianos se puede determinar en un solo ensayo. Los resultados no proporcionan valores reales de MIC (concentracion inhibitoria minima), pero se interpretan como susceptibles, intermedios o resistentes en base a la comparacion de zonas de inhibicién con una tabla estandarizada. Método Kirby-Bauer de prueba de susceptibilidad antimicrobiana En el gjercicio virtual Kirby-Bauer, se presenta una de las tres placas aleatorias de ensayo de Kirby-Bauer, que contienen Staphylococcus aureus, Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa que se han probado para detectar la susceptibilidad a 13 antibioticos diferentes. Usando la regla virtual (el raton), se puede medir el didmetro de cada zona de inhibicion. Estos valores luego se comparan con una tabla estandar de estandares interpretativos a la derecha de la placa, que proporciona un resultado resistente, susceptible o intermedio para cada antibiotico. El cuadro correspondiente a cada resultado es en vivo y se puede hacer clic con el 84

5. Continue por cada disco hasta que toda la placa haya sido marcada y la tabla esté completa. Materiales: Utilizamos el modulo de Michigan State University, Virtual Interactive Bacteriology Laboratory. Material de la clase. Desarrollo: Luego de haber observado y analizado el procedimiento de tefiir. Independiente, utilice el mddulo de Michigan State University, Virtual Interactive Bacteriology Laboratory en la parte de Susceptibilidad antimicrobiana para practicar los pasos del procedimiento anterior. Guarde con usted el resultado final de la practica. En grupo de cuatro desarrolle las siguientes preguntas para ser discutidas en clase, con lo observado en este mddulo y los conocimientos adquiridos en clase: 1. ¢;Qué son las pruebas de resistencia a antibiéticos? 2. (Cuadl es 1a metodologia que se utiliza para esta identificacion? 3. ¢(CoOmo interpreto un resultado de laboratorio? 86